一、 项目来源与背景

　　本项目来源于宁德市医药卫生类科技计划项目（项目编号：20100133）。强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis ,AS) 是一种主要累及脊柱和骶髂关节为特征的系统性炎性疾病，在临床上多数表现以腰部疼痛、僵硬和活动受限，部分患者可有外周关节炎、肌腱端病、眼炎及其他关节外表现。在我国的发病率为0.2-0.54%。AS尚无根治方法。但AS患者如能得及时诊断及合理治疗，可以控制症状并改善预后。强直性脊柱炎的发生与遗传、慢性感染、自身免疫功能紊乱和内分泌失调等有关, 特别是遗传因素与该病关系尤为密切, AS患者中约90%以上具有HLA-B27抗原，而正常人群只有7%左右，因此临床上以检测HLA-B27做为早期诊断疑似患者的参考依据。HLA-B27是B基因座编码的MHCⅠ类表面抗原，位于第6染色体。目前，依据IMGA/HLA Database Release 3.9.0 HLA-B27等位基因数据库，HLA-B27目前已经发现有99个亚型，命名依次从B2701-B2799。在中国汉族人群中，HLA-B*2704与HLA-B*2705构成了HLA-B27的优势亚型，同时还存在HLA-B*2702、2706、2707等，但不同地区、民族和人种之间HLA-B27亚型与AS的关联是有区别的，且不同HLA-B27亚型基因与AS的关联也存在差异。本课题拟研究本地区HLA-B27各亚型基因分布情况及与强直性脊柱炎相关性，探讨AS的遗传等因素，为AS的预防、诊断和治疗提供参考依据。

　　二、 技术原理及技能指标

　　1、技术原理

　　（1）流式细胞术（flow cytomet ry，FCM ）检测HLA-B27表达 根据直接荧光染色的原理，利用荧光标记的抗HLA-B27的单克隆抗体和淋巴细胞表面的B27抗原结合，使细胞具有一定的荧光强度，这种荧光的强度可被流式细胞仪测得的通道值反映。

　　（2）聚合酶链式反应-序列特异性引物法（PCR-SSP）检测HLA-B27表达及其亚型 本方法基于聚合酶链式反应-序列特异性引物法（PCR-SSP）反应原理，引物3'末端的第一个碱基与等位基因特异性碱基互补，特异性引物对仅扩增与其相匹配的等位基因。

　　（3）HLA-B27基因测序分析 新的HLA-B27等位基因不断快速增加，应用单一PCR-SSP法检测HLA-B27新基因型存在有一定的局限性。为应对日益复杂的HLA多态性序列，目前多采用PCR－直接测序法来鉴定新的等位基因。以PCR扩增HLA-B27基因第2、3外显子的基因片断，然后对DNA序列进行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。

　　2、技术路线

　　(1)流式细胞术HLA-B27阳性筛查 收集从2009年9月至2015年3月以来本院就诊的2361例临床疑似AS患者，抽取EDTA抗凝血。应用流式细胞仪HLA-B27－FITC/B7-PE双荧光染色法进行HLA-B27阳性筛查。阳性判断标准：HLA-B27 MFI>8.0，且HLA-B27+/HLA-B7-细胞百分比>80%。

　　（2）PCR-SSP法检测HLA-B27表达 利用PCR-SSP法对流式细胞术HLA-B27筛查阳性样本进行HLA-B27基因扩增。

　　（3）PCR-SSP法和荧光定量PCR染料法对HLA-B27亚型分析 应用HLA-B27基因分型检测试剂盒对HLA-B27筛查阳性样本进行亚型鉴定。

　　（4）HLA-B27基因测序分析 针对PCR-SSP法与流式细胞仪检测结果不符的样本，采用等位基因特异性引物扩增HLA-B27基因第2、3外显子，PCR产物经胶回收并送上海生工生物工程有限公司进行测序。

　　三、 技术的创造性与先进性

　　(1)首次采用序列特异性引物聚合酶链式反应技术联合流式细胞分析对闽东地区强直性脊柱炎患者HLA-B27基因进行筛查。

　　(2)首次应用PCR-SSP法和荧光定量PCR染料法获得了闽东地区强直性脊柱炎主要相关的HLA-B27亚型（B*2704），为探讨闽东地区强直性脊柱炎的发病机制打下了基础。

　　四、 技术成熟程度，适用范围和安全性

　　序列特异性引物聚合酶链式反应技术和流式细胞分析已广泛应用于HLA-B27的临床筛查。PCR-SSP方法借助荧光定量PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过特异性熔解曲线分析及电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。

　　五、 应用情况及存在问题

　　采用序列特异性引物聚合酶链式反应和流式细胞分析技术分析HLA-B27基因亚型与AS的相关性在本地区广泛推广应用，获得良好的社会经济效应。

　　为了进一步明确本地区HLA-B27基因各亚型基因分布情况及其与AS的相关性，本项目所分析的样本量还有不足，还有必要进一步加大AS 患者HLA-B27基因的筛查及其亚型的鉴定。